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CHO 細胞簡介：

CHO 細胞是中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese Hamster Ovary) 的簡稱，在生命科學(xué)研究中具有重要作用。CHO 細胞于 50 年代首次應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，目前是生物治療藥物 (單抗、酶、激酶和激素等) 中最常用的非人類哺乳動物細胞系。

2014 年至 2018 年，大多數(shù) (約 84%) 批準(zhǔn)的單抗藥來源于 CHO 細胞 (Walsh，2018)。CHO 細胞來源的單抗可應(yīng)用于各種適應(yīng)癥，包括腫瘤、多發(fā)性硬化癥、哮喘、HIV 和神經(jīng)母細胞瘤等。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)出多種 CHO 細胞系，1. 1956 得到的 CHO-K1(即野生型 CHO 細胞)；2. 敲除 CHO-K1 單 DHFR(二氫葉酸還原酶) 等位基因得到的 CHO-DXB11；3. 通過電力輻射 CHO 細胞群得到兩個 DHFR 等位基因都被敲除的 CHO-DG44。雖然 CHO 細胞還有其他衍生細胞系，但是目前進行 CHO 細胞系改造，多以這三種為初始細胞。CHO 細胞系經(jīng)過基因改造，可提高生產(chǎn)力，減少細胞凋亡并改善糖基化（Zhu 等人 2017）。 金斯瑞也開發(fā)了一系列高表達細胞系用于抗體表達。

懸浮細胞培養(yǎng)搖瓶

CHO 細胞特點：

1. 更適用于懸浮培養(yǎng)，可以滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的要求；

2. 生產(chǎn)的抗體分子結(jié)構(gòu)、功能方面和天然抗體分子較接近；

3. 所含病毒極少，外源基因可以在 CHO 細胞中穩(wěn)定地整合，并進行高效擴增和表達；

4.CHO 細胞是成纖維細胞，幾乎不分泌內(nèi)源性蛋白，因此對目標(biāo)重組抗體的分離純化工作非常有利。但是用于生物治療藥物的細胞系的選擇受到多種因素的影響，例如生產(chǎn)蛋白質(zhì)類型和重組蛋白質(zhì)的糖基化圖譜。

細胞工廠

據(jù)報道，CHO 與 HEK293 細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在糖基化和糖結(jié)構(gòu)上存在顯著差異 (Croset 等，2012；Goh,Ng 等，2018)。因此，在生物治療性蛋白質(zhì)開發(fā)階段中始終使用特定的細胞表達系統(tǒng)至關(guān)重要。并且，治療性單克隆抗體開發(fā)中，使用 CHO 瞬時表達，是初期體外實驗的較佳選擇。利用重組單克隆抗體的高產(chǎn)量 CHO 穩(wěn)定表達是通往后期臨床前階段的一條推薦途徑。這種方法增加了候選物保留經(jīng)藥理和毒理學(xué)表征的既定糖基化模式的可能性（Jain 等人 2017，Sifiniotis 等人 2019）

表達系統(tǒng)開發(fā)：

CHO 細胞系開發(fā)的目標(biāo)是改造 CHO 細胞以表達大量重組蛋白，并在細胞倍增時穩(wěn)定地保持這種生產(chǎn)水平?；镜牟呗匀缦拢?

1. 表達載體構(gòu)建-質(zhì)粒：

質(zhì)粒包括重組蛋白和靶細胞必需的遺傳元件。目的基因的序列在密碼子、tRNA 使用、GC 含量、核糖體結(jié)合序列和去除不必要的二級結(jié)構(gòu)等方面進行優(yōu)化，從而提高重組蛋白的表達。金斯瑞基于「人群免疫算法」的算法開發(fā)了免費的 GenSmart? Codon Optimization 密碼子優(yōu)化工具，旨在通過對野生型或重組基因序列的優(yōu)化，來提高在原核或哺乳動物表達系統(tǒng)中蛋白表達量。質(zhì)粒中的啟動子來源于病毒、小鼠或人類中，可引導(dǎo)重組蛋白表達。鼠或人源的巨細胞病毒啟動子 (CMV) 是常用的啟動子，弱啟動子猿猴病毒 40 (SV40) 和勞斯肉瘤病毒 (RSV) 啟動子也是較常使用的啟動子。其他經(jīng)常使用的啟動子包括 CHO-EF1 α(CHEF1)、CR5 等。通常來說，強啟動子用于基因表達，弱啟動子用于表達選擇基因。

為了篩選表達目的蛋白的細胞，質(zhì)粒中包含篩選基因，例如產(chǎn)生氨基糖苷 30 -磷酸轉(zhuǎn)移酶 (APH 30 II) 的 neo 基因用于 G418 抗性，hph 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因用于潮霉素抗性，Shble 基因用于抗性 zeocin，或 pac 基因編碼的嘌呤霉素 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶用于嘌呤霉素抗性。

2. 遞送系統(tǒng)選擇：

轉(zhuǎn)染是指由生物、化學(xué)或物理等方法將外部核酸轉(zhuǎn)移到細胞的過程。為獲得最佳的表達效果，必須具有有高轉(zhuǎn)染效率、低細胞毒性且對細胞正常的生理過程有最低的影響。生物方法采用病毒載體作為遞送方式。逆轉(zhuǎn)錄病毒將 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞有很長的歷史，但是直到近期才應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?；瘜W(xué)方法涉及各種陽離子試劑，如磷酸鈣、脂質(zhì)和聚合物等。CaPO4 沉淀是最早的方法，但已被更方便的基于脂質(zhì)的試劑（Lipofectamine）所替代。聚乙烯亞胺 (PEI) 是一種低成本的化學(xué)替代方法。 顯微注射、磁性納米粒子磁化和電穿孔是物理的方法。 由于方便且沒有知識產(chǎn)權(quán)保護，電穿孔成為工業(yè)制造生物治療細胞系的首選方法。 轉(zhuǎn)染根據(jù)細胞系和 DNA 遞送方法的不同，效率可以從 5% 到 100% 不等。 CHO 細胞使用 CaPO4 可達到 5–40%，脂質(zhì)可達到 20–60%，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可達到約 100%。

3. 鑒定高表達克隆細胞：

鑒定高表達的細胞是細胞系開發(fā)中的重要一步。有效的篩選方法可以加速獲得目標(biāo)細胞系。傳統(tǒng)篩選方法是有限稀釋法，將細胞通過有限稀釋到較低的細胞密度，然后將細胞轉(zhuǎn)移到 96 空板，接著利用 ELISA 鑒別表達量最高的克隆。同時，用于自動化識別單克隆的儀器比如：ClonePix?、Pickolo?，他們能夠在半固體培養(yǎng)基中挑選高表達集落，并通過 LEAP?富集高表達細胞。雖然細胞系的單克隆性引起了監(jiān)管部門的注意，但是目前沒有可用的監(jiān)管指南。證明細胞系單克隆的最佳方法是在初步篩選的過程中對細胞及進行成像，以證明所選擇細胞系來自于同一個細胞。

4. 穩(wěn)定高表達細胞系擴大培養(yǎng)-細胞庫：

一旦確定了主要候選細胞系，需要制備每個細胞系的研究細胞庫 (RCB，Research Cell Bank)，然后從 RCB 制備開發(fā)細胞庫 (DCB，Development Cell Bank)。DCB 用于生物制品開發(fā)以及早期研究材料的生成。對于小型研究項目，可能只需要少量凍存細胞。然而，為了繼續(xù)提供用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的細胞系，通常最好準(zhǔn)備兩種細胞庫：主細胞庫 (MCB，Main Cell Bank) 和工作細胞庫 (WCB，Working Cell Bank)。MCB 由表達適合水平的穩(wěn)定單個細胞系構(gòu)成，WCB 來自于 MCB。每個 MCB 和 WCB 通常包括 100–300 凍存樣品。若 WCB 在生產(chǎn)過程中用完，可用 MCB 生成新的 WCB。 MCB 和 WCB 應(yīng)在使用前進行充分表征無菌性、無支原體和外來病毒污染。

5. 細胞穩(wěn)定性確認：

細胞系的特性在長時間連續(xù)傳代期間可能會發(fā)生變化，例如，細胞系可能會失去表達能力。因此，對細胞進行表征以確保大規(guī)模生產(chǎn)的一致性并確保維持源自細胞的蛋白質(zhì)的特性至關(guān)重要。

對于生產(chǎn)細胞系，必須建立所需特征的可接受穩(wěn)定性水平，并且必須定義最大傳代數(shù)以便在低傳代和廣泛傳代后可以對細胞特征進行比較。必須進行肽圖譜、氨基酸測序、DNA 指紋圖譜、基因拷貝數(shù)和表型標(biāo)記測定等測試，以確保細胞的遺傳穩(wěn)定性。此外，必須檢查細胞表達蛋白量和產(chǎn)品質(zhì)量以評估細胞系的穩(wěn)定性。

一個好的生產(chǎn)細胞系應(yīng)該能夠在達到大規(guī)模生產(chǎn)結(jié)束所需的多代中保持其生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量。在大多數(shù)情況下，保持 50 代的穩(wěn)定性將滿足大規(guī)模制造的嚴(yán)格要求 。