細(xì)菌生物膜也叫菌膜，于19世紀(jì)20年代由Angst觀察船體表面上海洋細(xì)菌時(shí)提出。隨著顯微鏡技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們對菌膜的研究越來越深入。在所有的檢測方法中，利用96孔板進(jìn)行菌膜的定量檢測是一種操作簡單、且成本低廉的方式。
96孔板測定法用于觀察靜置培養(yǎng)的細(xì)菌菌膜，是目前測量菌膜生成常用的方法。其需要的儀器及操作步驟如下：
主要試劑和儀器：
聚苯乙烯96孔板，PBS緩沖液，甲醇，1%的結(jié)晶紫溶液，33%的冰醋酸溶液，酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
(1)將培養(yǎng)液100μl加入96孔聚苯乙烯微板培養(yǎng)板的各孔中，接種過夜培養(yǎng)液10μl，在37℃下孵育36小時(shí)。
(2)吸出培養(yǎng)液，向每個(gè)孔中加入200μl無菌PBS緩沖液，洗滌平板孔3次;
(3)在每孔中加入100μl甲醇，持續(xù)15分鐘，然后吸出培養(yǎng)孔中的甲醇，自然風(fēng)干;
96孔板可拆卸
(4)向每個(gè)孔中加入100μl1%的結(jié)晶紫溶液，并在室溫下染色5分鐘;
(5)將培養(yǎng)液中的結(jié)晶紫染色液吸出后，用流水沖洗掉多余的染料;
(6)倒置濾紙上的板以除去殘留的水，并在37°C的烤箱中干燥或在室溫下干燥;
(7)完全干燥后，向各孔中加入100μl的33%冰醋酸溶液，并在37℃的恒溫箱中作用30分鐘，使結(jié)晶紫溶解。
(8)用酶標(biāo)儀在590nm處測量培養(yǎng)孔中溶液的OD值;
(9)在每個(gè)測試中為每個(gè)菌株重復(fù)3孔，并取3個(gè)平均值(D值)作為測試值;
(10)將未接種細(xì)菌的培養(yǎng)液用作陰性對照，該陰性值為極限值(Dc)的兩倍。
結(jié)果判斷：
根據(jù)D值，應(yīng)變可以分為三類：
(1)生物膜形成力強(qiáng)(D> 2×Dc);
(2)生物膜形成力弱(Dc<D≤2×Dc);
(3)沒有生物膜形成應(yīng)變(D≤Dc)。
以上是利用96孔板對細(xì)菌生物膜進(jìn)行定量檢測的具體步驟，在操作時(shí)需要注意氣流方向，可能帶菌的物品、手不要在上風(fēng)處移動，以免影響檢測結(jié)果。
